上海交大发文助力c-di-GMP调控结核杆菌耐药新机制研究)---文献解析

发布时间：2017年7月30日来源：博翀生物

来自上海交通大学系统生物医学研究院的陶生策研究团队，证实第二信使环二核苷酸（c-di-GMP）可以通过调控ethr-etha途径加强耻垢分枝杆菌对ETH的耐药性，并从结构上解释了这一具体机制。这一研究成果发布在2017年7月19日的Scientific Reports上。

肺结核（tuberculosis）是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病，一直危害人类生命健康。2016年WHO统计（图一），2015年有1040万人新发患有结核病，180万人因该病死亡。此外，全世界约有48万人是MDR/XDR-TB，在中国有7万人为MDR/XDR-TB。目前临床上应用的一线药物：利福平（RFA）、异烟肼（INH）、吡嗪酰胺和乙胺丁醇，主要针对活动性、对药物敏感性的肺结核病。二线抗结核药物包括乙硫异烟胺（ETH）、丙硫异烟胺、丁胺卡那等，也逐渐出现不同程度的耐药性问题。虽然新开发的抗结核药物有贝达喹啉、德拉马尼等，但仍不足以对付耐药结核病。

图一 2015年全球TB发病情况

c-di-GMP是在一种普遍存在于原核生物界的第二信使分子，在原核生物体内广泛存在，且参与重要的生物学功能，比如生物膜形成、细菌的运动性、毒性分子的产生、细胞周期和分化等（图二）。但是目前已知的靶点不足以解释其广泛调控作用，尤其在分枝杆菌中c-di-GMP更只有零星研究。

图二 c-di-GMP的合成、降解及信号调控

研究团队前期应用MtbProt?结核分枝杆菌全蛋白质组芯片（芯片包含了4262种结核分枝杆菌重组蛋白，覆盖～95%结核分枝杆菌编码基因），在结核分枝杆菌中发现了至少30个重要的c-di-GMP直接相互作用蛋白，其中包括EthR。EthR是一个转录抑制因子，抑制二线药物ETH的激活剂EthA的转录。ETH和INH的作用机制相同，在被激活后作用于分枝菌酸合成途径中的还原酶InhA，但由于其毒性，目前作为一个二线药物使用，再加上耐药性问题的出现，所以一直不能很好的应用于治疗结核病。基于此，文中针对EthR靶点，对c-di-GMP在分枝杆菌中的调控机制进行深入研究。

首先，采用紫外交联-电泳和生物膜干涉的方法，团队验证了c-di-GMP和EthR的体外结合，并获得了结合解离常数。采用EMSA和生物膜干涉的方法研究了c-di-GMP对EthR的体外活性的影响。结果表明c-di-GMP与EthR的结合，可明显加强EthR与下游基因etha启动子的结合，并影响EthR和etha启动子区域结合的动力学常数。体内活性实验同样验证了此结果。
其次，通过药敏实验和杀菌曲线的测定，表明体内c-di-GMP水平的升高增强了耻垢分枝杆菌对ETH的耐药性，但是不影响对RFA和INH的敏感性。进一步，对耻垢菌株在添加一定量ETH的培养条件下的生长曲线进行了测定，结果表明c-di-GMP水平的升高有利于耻垢菌株的生长，并且依赖于ethr进行调控（图三）。

图三 c-di-GMP加强耻垢分枝杆菌对ETH的耐药性

通过结构模拟，研究团队发现c-di-GMP结合在EthR的Q125、R181和E190这三个氨基酸上，而这三个氨基酸是位于EthR的同源二聚体的中心口袋中（图四）。进一步的c-di-GMP与位点突变的EthR的结合验证实验表明了上述位点的重要性。进一步的结构模拟发现，c-di-GMP与EthR的结合模式在TetR家族蛋白中具有普遍性。

图四 c-di-GMP和EthR结合的结构图

由此，科学家们得到了一种可定能ETH耐药机制：c-di-GMP结合在EthR的Q125、R181、E190上，有利于维持EthR的同源二聚体的构象，进而有利于EthR与etha启动子区域的结合来抑制etha的转录，最后由于体内较少的EthA激活ETH，从而导致了ETH的耐药性（图五）。

图五 c-di-GMP通过ethr-etha途径调控ETH的耐药性

该研究不仅发现了一种新型的耐药性产生的方式——由小分子调控引起的，不再是传统的位点突变或修饰改变引入的耐药问题，同时也发现了c-di-GMP的一种新的调控功能及作用机制——通过结合TetR家族蛋白调控耐药性，不再是调控生物膜形成等引起耐药性问题。该发现对于研究结核分枝杆菌及对肺结核用药均有指引作用。

研究团队使用的MtbProt^?结核分枝杆菌全蛋白质组芯片由广州博翀生物科技有限公司提供，可用于全局性的发现目标蛋白、小分子药物、核酸的相互作用蛋白，以为解析其作用机制提供线索。

博翀生物是国家高新技术企业，中国科学院生物物理研究所成果转化的标杆企业，广州市企业研发机构，专注于蛋白质芯片，是中国蛋白质芯片领域的领导企业，相继构建了世界独一无二的基于高纯度蛋白质的MtbProt^?结核分枝杆菌蛋白质组芯片、登革热蛋白质组芯片、凝集素蛋白质芯片、大肠杆菌蛋白质组芯片，酵母蛋白质组芯片等，代理美国CDI公司, 目前世界上最高通量的HuProt^TM人蛋白质组芯片，同时销售一系列细胞因子科研试剂盒，可提供血清标志物筛选、药物作用靶标发现、抗体特异性筛选、蛋白-核酸互作、蛋白-蛋白互作，蛋白翻译后修饰研究等多项蛋白水平组学技术服务项目。

全文链接：
Cyclic di-GMP regulates Mycobacterium tuberculosis resistance to ethionamide. Hai-Nan Zhang, et al. Scientific Reports 7, Article number: 5860 (2017).

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